COVID-19関連追加(2020527日)

 

COVID-19の血管新生Angiogenesisについて】

Ackermann M, et al. Pulmonary Vascular Endothelialitis, Thrombosis, and Angiogenesis in Covid-19. N Engl J Med. May 21, 2020.

doi: 10.1056/NEJMoa2015432.

★血管新生angiogenesis

@発芽(sprouting):内皮細胞が発芽して血管のない部分へ伸びていく.

A嵌入(intussusception):拡張した血管腔に隔壁が生じて複数の血管に分離していく.

METHODS

COVID-19で死亡した患者7例の剖検肺組織(女性2mean 68±9.2歳,男性5mean 80±11.5歳),インフルエンザ(H1N1)によるARDSで死亡した患者7例の剖検肺組織(女性2mean 62.5±4.9歳,男性5mean 55.4±10.9歳),そして肺移植ドナー10例の非感染肺組織(女性5mean 68.2±6.9歳,男性5mean 79.2±3.3歳)を年齢で調整し形態・分子学的に比較した.Micro CT,組織病理,マルチプレックス免疫組織化学染色,電子顕微鏡,(血管)鋳型法,ダイレクトマルチプレックス遺伝子発現解析によって包括的にすべてに肺組織を分析した.

RESULTS

GROSS EXAMINATION

インフルエンザ感染によるARDS剖検肺の重量はCOVID-19よりも有意に重かった(2404±560 g vs 1681±49 g; p= 0.04.非感染肺重量(1045±91 g)はインフルエンザ(p= 0.003),COVID-19p < 0.001)と比べると有意に軽かった.

ANGIOCENTRIC INFLAMMATION

COVID-19肺病理像は肺胞被覆細胞,U型肺胞上皮細胞,線状の肺胞内フィブリン沈着と伴ったびまん性肺胞傷害(DAD: diffuse alveolar damage)であった(Figure 1).4例では軽度の間質浮腫のみを伴う局所の変化であった.3例は早期の肺胞腔内器質化とともに,均一なフィブリン沈着と著明な間質浮腫を認めた.インフルエンザ肺病理像は全例に著明な間質浮腫と広範なフィブリン沈着を伴う赤色を呈する(floridDADを認めた.加えて,インフルエンザ肺の3例は局所の器質化と吸収性の炎症性変化であった.これらの変化はインフルエンザ剖検肺の重量が重かったことを示唆する.

ACE2発現を分析するために免疫組織化学染色を行い,一視野あたりのACE2陽性細胞をカウントした(mean (±SD) relative counts of ACE2-positive cells/field of view).非感染肺組織における肺胞上皮細胞(0.053±0.03)および毛細血管内皮細胞(0.066±0.03)のACE2発現は稀であったCOVID-19剖検肺およびインフルエンザ剖検肺におけるACE2陽性細胞は,それぞれの肺胞上皮細胞(0.49±0.28, 0.55±0.11),毛細血管内皮細胞(0.22±0.18, 0.15±0.09)であった.さらに非感染肺組織における血管周囲組織や肺胞内には認めなかったが,COVID-19肺とインフルエンザ肺にはACE2陽性リンパ球が認められた(0.22±0.18, 0.15±0.09

COVID-19肺およびインフルエンザ肺の患者1例につき20視野における前毛細血管・後毛細血管壁の半径200μm内に認められたCD3陽性T細胞数は,それぞれ26.2±13.114.8±10.8であった.同様の視野サイズの観察ではCD4陽性T細胞数はインフルエンザに比べてCOVID-19では有意に多かった(5.8±2.5 vs 13.6±6.0, p= 0.04が,CD8陽性T細胞は有意に少なかった(11.6±4.9 vs 5.3±4.3, p= 0.008肺胞上皮に沿って存在している好中球数(CD15陽性)はインフルエンザに比べてCOVID-19で有意に少なかった(4.8±5.2 vs 0.4±0.5, p= 0.002

The nCounter Inflammation Panel (NanoString Technologies)249の炎症関連遺伝子についてマルチプレックス解析を行ったところ,COVID-19とインフルエンザでは相同性・相違性が認められた.COVID-19肺では79の炎症関連遺伝子が特異的に認められたが,インフルエンザ肺では2つの遺伝子のみであった.発現パターンが共通であったのは7つの遺伝子であった.

THROMBOSIS AND MICROANGIOPATHY

COVID-19およびインフルエンザ剖検肺の肺血管系に対してhematoxylin-eosinHE),trichrome,そして免疫組織化学染色を行った.前毛細血管を分析すると,COVID-19剖検肺4例,インフルエンザ剖検肺4例に直径1mm-2mmの肺血管に血栓が認められた(完全内腔閉塞はない).両群すべての例に肺胞毛細血管にフィブリン血栓を認めた(Figure 2).肺胞毛細血管微小血栓数がCOVID-19肺はインフルエンザ肺の9倍であった(血管腔領域cm2あたりの血栓数, 159±73 vs 16±16; p= 0.002

直径1mm未満の後毛細血管の血管内血栓数はインフルエンザよりCOVID-19で少なかった(35±16 vs 12±14, p= 0.02).剖検肺のすべてのセグメントに血管病変が認められたのがCOVID-192例,インフルエンザは4例であった:COVID-19剖検肺3例,インフルエンザ剖検肺3例においては,動脈血栓はなかったが毛細血管・静脈血栓が認められた.

病理所見は肺組織のthree dimensional micro CTで確認した:両群ともに前毛細血管および後毛細血管の完全閉塞に近い状態が認められた.

ANGIOGENESIS

電子顕微鏡と微小血管鋳型法を用いて,それぞれの群の肺組織の微小血管構造改変を精査した.COVID-19肺では構造的に変形した毛細血管とともに歪んだ血管が認められた(Figure 3COVID-19肺の拡張した毛細血管には,急な血管径の変化や毛細血管内の嵌入した隔壁・柱(intussusceptive pillarsが認められた(Figure 3C.電子顕微鏡によってCOVID-19肺における超構造的な内皮傷害および細胞内のSARS-CoV-2の存在が認められた(Figure 3D.ウイルスは細胞外間隙にも認められた.

COVID-19肺における嵌入性血管新生(intussusceptive angiogenic features)の密度(一フィールドあたり60.7±11.8)はインフルエンザ肺(22.5±6.9)の2.7倍大きく,一方非感染肺では2.1±0.6であった(p< 0.001)(Figure 4A従来の発芽性血管新生の密度もCOVID-19肺はインフルエンザ肺よりも大きかった(Figure 4B

入院期間の延長ととともにCOVID-19肺の嵌入性血管新生の程度は増加したが,インフルエンザ肺では少なく,時間依存性の増加は認めなかった(p< 0.001)(Figure 4C発芽性血管新生については両群とも同様の変化であった(Figure 4D

The nCounter Inflammation Panel (NanoString Technologies)323の血管新生関連遺伝子についてマルチプレックス解析を行ったところ,COVID-19とインフルエンザでは相違性が認められた.COVID-19肺では69の血管新生関連遺伝子が特異的に認められたが,インフルエンザ肺では26の遺伝子のみであった.発現パターンが共通であったのは45の遺伝子であった(Figure 5).

DISCUSSION

COVID-19angiocentric featuresには,@細胞内のSARS-CoV-2と関連した重篤な内皮傷害と内皮細胞細胞膜の断絶,A微小血管障害と肺胞毛細血管閉塞を伴った広範な血管内血栓,B著明な嵌入性血管新生,という3つの特徴がある.

COVID-19肺の内皮炎と血栓の程度が発芽性あるいは嵌入性血管新生の頻度に寄与するかもしれない.これらの所見と臨床経過を明確にするためにはさらなる研究が必要だ.

・それぞれの患者の死亡時期は異なっている.しかし,インフルエンザ患者では嵌入性血管新生は安定しているか非常に少ない状態であったが,COVID-19患者では明らかに嵌入性血管新生は入院経過とともに増加した.以前に我々は,嵌入性血管新生が慢性肺傷害の晩期に見られることを報告した1)

非感染肺よりもCOVID-19肺およびインフルエンザ肺におけるACE2陽性細胞数が非常に多いことが示されたACE2陽性内皮細胞数の増加および内皮の形態学的変化が証明され,COVID-19vascular phaseにおいて内皮細胞が中心的な役割を担うことが推測される

・内皮細胞内のSARS-CoV-2の存在は,内皮傷害に関与する血管周囲の炎症のみならずウイルスの直接的な傷害が示唆される.

1) Ackermann M, et al. Morphomolecular motifs of pulmonary neoangiogenesis in interstitial lung disease. Eur Respir J 2020; 55(3): 1900933.

 

 

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Figure 1: The gross appearance of a lung from a patient who died from coronavirus disease 2019 (Covid-19) is shown in Panel A (the scale bar corresponds to 1 cm). The histopathological examination, shown in Panel B, revealed interstitial and perivascular predominantly lymphocytic pneumonia with multifocal endothelialitis (hematoxylin–eosin staining; the scale bar corresponds to 200 μm).

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Figure 2: The interalveolar septum of this patient (Patient 4 in Table S1A in the Supplementary Appendix) shows slightly expanded alveolar walls with multiple fibrinous microthrombi (arrowheads) in the alveolar capillaries. Extravasated erythrocytes and a loose network of fibrin can be seen in the intraalveolar space (hematoxylin–eosin staining; the scale bar corresponds to 50 μm).

 

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Figure 3: Panels A and B show scanning electron micrographs of microvascular corrosion casts from the thin-walled alveolar plexus of a healthy lung (Panel A) and the substantial architectural distortion seen in lungs injured by Covid-19 (Panel B). The loss of a clearly visible vessel hierarchy in the alveolar plexus is the result of new blood-vessel formation by intussusceptive angiogenesis. Panel C shows the intussusceptive pillar localizations (arrowheads) at higher magnification. Panel D is a transmission electron micrograph showing ultrastructural features of endothelial cell destruction and SARS-CoV-2 visible within the cell membrane (arrowheads) (the scale bar corresponds to 5 μm). RC denotes red cell.

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Figure 4: Angiogenic features of sprouting and intussusceptive angiogenesis (intussusceptive pillars and sprouts, respectively) were counted per field of view in microvascular corrosion casts of lungs from patients with Covid-19 (red), lungs from patients with influenza A(H1N1) (blue), and control lungs (white). In Panels A and B, the numeric densities of angiogenic features are summarized as box plots for intussusceptive and sprouting angiogenesis. The boxes reflect the interquartile range, and the whiskers indicate the range (up to 1.5 times the interquartile range). Outliers are denoted by singular points. A statistical comparison between lungs from patients Covid-19 and those from patients with influenza and uninfected control lungs showed a significantly higher frequency of angiogenesis in the patients with Covid-19 lungs, especially intussusceptive angiogenesis (P values were calculated with Student’s t-test, controlled for the familywise error rate with a Benjamini–Hochberg false discovery rate threshold of 0.05). Panels C and D show a chronological comparison of intussusceptive and sprouting angiogenesis in lungs from patients with Covid-19 and lungs from patients with influenza A(H1N1) plotted as a function of the duration of hospitalization. The numbers shown are Pearson correlation coefficients and P values (all displayed P values of 0.05 or lower also pass the false discovery rate threshold of 0.05). The median angiogenic feature count for each patient is displayed as one dot. The shaded areas encompassing the dotted linear regression lines are smoothed 95% confidence intervals. As a reference for increased blood-vessel formation in lung diseases, intussusceptive and sprouting angiogenesis as found in end-stage nonspecific interstitial pneumonia (NSIP), a chronic interstitial lung disease, at the time of lung transplantation (a mean of 1650 days from first consultation to lung transplantation) are shown (purple box plots). Findings in healthy control lungs are also indicated (white box plots). The white and purple box plots are displayed in relation to the y axis but not the x axis (as indicated by vertical dashed lines).

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Figure 5: RNA was isolated from sections sampled directly adjacent to those used for complementary histologic and immunohistochemical analyses. RNA was isolated with the Maxwell RNA extraction system (Promega) and, after quality control through Qubit analysis (ThermoFisher), was used for further analysis. During the NanoString procedure, individual copies of all RNA molecules were labeled with gene-specific bar codes and counted individually with the nCounter Analysis System (NanoString Technologies). The expression of angiogenesis-associated genes was measured with the NanoString nCounter PanCancer Progression panel (323 target genes annotated as relevant for angiogenesis). The resulting gene-expression data were normalized to negative control lanes (arithmetic mean background subtraction), positive control lanes (geometric mean normalization factor), and all reference genes present on the panel (geometric mean normalization factor) with the use of nSolver Analysis Software, version 4.0. Shown in the Venn diagram are only genes that are statistically differentially expressed as compared with expression in controls in both disease groups (Student’s t-test, controlled for the familywise error rate with a Benjamini–Hochberg false discovery rate threshold of 0.05). Up-regulation and down-regulation of genes is indicated by colored arrowheads suffixed to the gene symbols (purple denotes up-regulation, red denotes down-regulation).